فرمت فایل : WORD (قابل ویرایش)
تعداد صفحات:146
پایان نامه کارشناسی ارشد رشته بیوشیمی
فهرست مطالب:
فصل اول: کلیات و هدف
1 1-1 سلول¬های بنیادی ............................................................................................................................................
1 1-1- 1 تعریف سلول¬های بنیادی.........................................................................................................................
2 1-1-2 ویژگی خودنوزایی سلول بنیادی.............................................................................................................
3 1-1-3 دسته¬بندی سلول¬های بنیادی بر اساس توان تمایزی آنها ................................................................
4 1-1-4 دسته¬بندی سلول¬های بنیادی بر اساس منشا ......................................................................................
4 1-1-4-1 سلول¬های بنیادی جنینی.....................................................................................................................
6 1-1-4-2 سلول بنیادی خون بند ناف.................................................................................................................
7 1-1-4-3 سلولهای بنیادی بزرگسالان.................................................................................................................
10 1-1-5 سلول¬های مغز استخوان ...........................................................................................................................
10 1-1-5-1 سلول¬های بنیادی خونساز....................................................................................................................
11 1-1-5-2 سلول مزانشیم مغز استخوان...............................................................................................................
12 1-2 تاریخچه سلول بنیادی مزانشیم ..................................................................................................................
13 1-2-1 مورفولوژی سلول بنیادی مزانشیم ..........................................................................................................
14 1-2-2 کنام سلول بنیادی مزانشیم مغز استخوان ...........................................................................................
15 1-2-3 ویژگی¬های اساسی سلول بنیادی مزانشیم ...........................................................................................
16 1-3 کاربردهای سلول بنیادی مزانشیم در درمان ............................................................................................
17 1-3-1 ترمیم استخوان ...........................................................................................................................................
17 1-4 بافت استخوان .................................................................................................................................................
20 1-5 استئوژنز(استخوان‌سازی) ..............................................................................................................................
21 1-5-1 استخوان¬سازی اولیه یا جنینی ................................................................................................................
23 1-5-2 استخوان¬سازی ثانویه ................................................................................................................................
23 1-5-3 دوباره¬سازی استخوان ................................................................................................................................
24 1-6 هتروژن بودن کشت سلول بنیادی مزانشیمی ...........................................................................................
25 1-6-1 شرایط آزمایشگاهی تمایز مزانشیم به استخوان ..................................................................................
25 1-6-2 تنظیم مولکولی تمایز به استخوان سلولهای بنیادی مزانشیمی .....................................................
27 1-6-3 نقش سیگنال دهی Wnt در تمایز سلول های بنیادی مزانشیم به استخوان ..............................
29 1-7 عنصر بور ..........................................................................................................................................................
30 1-7-1 مشتقات بور .................................................................................................................................................
32 1-7-2 فراوانی عنصر بور ........................................................................................................................................
32 1-7-3 تاریخچه مصرف بور ...................................................................................................................................
33 1-7-4 منابع طبیعی بور..........................................................................................................................................
34 1-7-5 اثرات بور برفلزات ضروری برای متابولیزم در جانوران .......................................................................
34 1-7-5-1 تاثیر بور بر فیزیولوژی بدن ................................................................................................................
36 1-7-5-2 تاثیر بور بر روی سرین پروتئازها .......................................................................................................
37 1-7-6 کاربرد بور در دارو .....................................................................................................................................
37 1-7-7 سرطان .........................................................................................................................................................
39 1-8 اثرات بور روی استخوان ................................................................................................................................
40 1-9 بور و خون .........................................................................................................................................................
41 1-10 بور در گیاهان ................................................................................................................................................
42 1-11 سمیت بور ......................................................................................................................................................
44 1-12 محدوده استفاده بور .....................................................................................................................................
45 مروری بر مطالعات گذشته .....................................................................................................................................
47 هدف مطالعه .............................................................................................................................................................
فصل دوم: مواد و روش¬ها
50 2-1 انتخاب رت ......................................................................................................................................................
50 2-2 جدا سازی وتکثیر سلولهای بنیادی مزانشیم مغز استخوان ................................................................
52 2-2-1 اجرای پاساژ ................................................................................................................................................
54 2-3 اثبات مزانشیم بودن سلول های استخراج شده ........................................................................................
54 2-3-1 تمایز به استخوان ......................................................................................................................................
55 2-4 بررسی توان زیستی سلولها (دوز فایندینگ) .............................................................................................
55 2-4-1 رنگ آمیزی تریپان بلو .............................................................................................................................
57 2-4-2 سنجش تترازولیوم (MTT) ...................................................................................................................
57 2-4-2-1 مراحل انجام سنجش MTT)غیر استئوژنیک( .............................................................................
58 2-4-2-2 ترسیم منحنی استاندارد با استفاده از سنجش تترازولیوم .........................................................
59 2-4-2-3 مراحل انجام تست MTT استئوژنیک ............................................................................................
60 2-5 انتخاب دوز مورد نظر ...................................................................................................................................
60 2-6 بررسی توان تکثیری سلول¬های بنیادی مزانشیم .....................................................................................
61 2-6-1 سنجش توانایی کلونی¬زایی .......................................................................................................................
63 2-6-2 محاسبه تعداد دوبرابرشدگی جمعیتی(PDN) ...................................................................................
62 2-7 بررسی تغییرات مورفولوژیکی با استفاده از رنگ آمیزی فلوروسنت .....................................................
65 2-8 آزمون¬های بیوشیمیایی در شرایط تمایز و غیرتمایزی ............................................................................
65 2-8-1تیمار و استخراج عصاره سلولی .................................................................................................................
65 2-8-2 بررسی فعالیت آنزیم¬ها ..............................................................................................................................
66 2-8-2-1 تهیه ی نمودار استاندارد برای آزمایش لاوری ...............................................................................
66 2-8-2-2 ترانس آمینازها .....................................................................................................................................
68 2-8-2-3 لاکتات دهیدروژناز................................................................................................................................
70 2-8-2-4 آنزیم آلکالین فسفاتاز ...........................................................................................................................
72 2-8-3 سنجش میزان رسوب ماتریکس معدنی به کمک رنگ آلیزارین رد در سلول های استئوژنیک
72 2-8-3-1 رسم منحنی استاندارد برای رنگ آمیزی آلیزارین رد .................................................................
73 2-8-3-2 بررسی رسوب ماتریکس استخوانی در نمونه های تیمار شده ...................................................
73 2-8-4 بررسی الکترولیت ها )کلسیم، سدیم و پتاسیم( ...............................................................................
73 2-8-4-1 بررسی میزان کلسیم داخل سلولی با استفاده از کیت کلسیم به روش رنگ سنجی ............
74 2-8-4-1-1 مراحل انجام تست کلسیم در سلول های تمایز یافته )استئوبلاست( ................................
75 2-8-4-1-2 مراحل انجام اندازه¬گیری میزان کلسیم ......................................................................................
76 2-8-4-2 اندازه¬گیری غلظت سدیم و پتاسیم سلول استئوژنیک و غیر استئوژنیک ................................
81 2-9 تجزیه و تحلیل آماری داده ها ......................................................................................................................
فصل سوم: نتایج
82 3-1 الف: نتایج مرحله اول ....................................................................................................................................
82 3-1-1 رشد و تکثیر سلولهای بنیادی مزانشیم ..............................................................................................
82 3-1-2 اثر اسید بوریک بر توانایی زیستی سلولهای بنیادی مزانشیم مغز استخوان رت ........................
85 3-1-3 بررسی مورفولوژی سلولهای تیمار شده ...............................................................................................
87 3-1-4 نتایج توانایی کلونی زایی، تعداد دوبرابر شدگی جمعیت سلول .....................................................
89 3-1-5 اثر اسید بوریک بر فاکتورهای بیوشیمیایی ........................................................................................
91 3-1-6 میزان الکترولیتها.......................................................................................................................................
92 3-2 نتایج اثر دوزهای انتخابی اسید بوریک بر شاخص های تمایز به استئوبلاست ................................
92 3-2-1 توانایی زیستی سلولها در روند تمایز .....................................................................................................
93 3-2-2 بررسی تغییرات مورفولوژیکی با استفاده از رنگ¬آمیزی فلورسنت در نمونه¬های استئوژنیک
96 3-2-3 بررسی اثر اسید بوریک بر فاکتورهای بیوشیمیایی سلولهای تمایز یافته ......................................
97 3-2-3-1 میزان معدنی شدن ماتریکس با سنجش رنگ آلیزارین رد ........................................................
100 3-2-3-2 میزان رسوب کلسیم ..........................................................................................................................
101 3-2-3-3 بررسی فعالیت آنزیم آلکالین فسفاتاز .............................................................................................
101 3-2-3-2 بررسی فعالیت آنزیم آسپارتات و آلانین ترانس آمیناز .................................................................
103 3-2-3-5 بررسی فعالیت لاکتات دهیدروژناز ..................................................................................................
103 3-2-3-6 بررسی سطح الکترولیت های سلولهای استئوژنیک .....................................................................
فصل چهارم: بحث و نتیجه¬گیری
105 4-3 اثر اسیدبوریک بر سلولهای مزانشیم ...........................................................................................................
105 4-1-1اثر اسید بوریک بر توانایی زیستی و توان تکثیر سلولها ......................................................................
108 4-1-2 بررسی تاثیر اسید بوریک بر تغییرات مورفولوژیکی ...........................................................................
109 4-1-3 اثر اسید بوریک بر فاکتورهای بیوشیمیایی ..........................................................................................
113 4-1-4 اثر اسید بوریک بر فعالیت آنزیمهای متابولیکی ................................................................................
116 4-2 اثر اسیدبوریک بر تمایز سلولی ..................................................................................................................
116 4-2-1 توانایی زیستی ............................................................................................................................................
119 4-2-2 بررسی سطح الکترولیت ها ......................................................................................................................
120 4-2-3 بررسی فاکتورهای استئوژنیک ...............................................................................................................
124 4-2-4 بررسی اثر اسید بوریک بر آنزیم های متابولیکی ...............................................................................
127 4-2-5 تاثیر اسید بوریک بر مورفولوژی سلولهای تمایزی ............................................................................
128 4-3 نتیجه گیری ...................................................................................................................................................
129 4-4 پیشنهادات ........................................................................................................................................................
فصل پنجم:ضمیمه
131 5-1 روش تهیه محیط کشت ...............................................................................................................................
131 5-2 تهیه ی فسفات بافر سالین PBS- ...........................................................................................................
132 5-3 تهیه ی فسفات بافر سالین مثبت PBS+..................................................................................................
132 5-4 روش تهیه محیط تمایزی استئوژنیک ........................................................................................................
133 5-5 آماده سازی آلیزارین رد ...............................................................................................................................
133 5-6 روش تهیه محلول تریپان¬بلو 4/0 درصد ...................................................................................................
133 5-7 تهیه کریستال ویولت ....................................................................................................................................
133 5-8 روش تهیه محلول MTT...........................................................................................................................
133 5-9 روش تهیه بافر شست و شو( ( Tris-Hcl-NaCl..............................................................................
133 5-10 مواد لازم و روش تهیه بافر استخراج ( Tris-Hcl) ...........................................................................
134 5-11 روش تهیه بافر ARS .................................................................................................................................
134 5-12 روش تهیه محلول BSA ...........................................................................................................................
134 5-13 روش تهیه محلول کمپلکس لاوری ......................................................................................................
135 5-14 روش تهیه بافر استخراج کلسیم .............................................................................................................
135 5-15 روش تهیه رنگ های فلورسنس هوخست و آکریدین اورنژ ................................................................
فهرست اشکال
2 شکل1-1: توانائی خودنوزائی و پتانسیل تمایز در سلولهای بنیادی ..............................................................
4 شکل 1-2: دسته¬بندی سلول¬های بنیادی براساس پتانسیل تمایزی آنها ....................................................
5 شکل 1-3: تصویر شماتیک از سلول¬های بنیادی جنینی ...............................................................................
6 شکل 1-4: نمایی از بند ناف و ژله وارتون ..........................................................................................................
11 شکل 1-5: سلول بنیادی خونساز ......................................................................................................................
13 شکل 1-6: عملکردهای اصلی سلول بنیادی مزانشیم .....................................................................................
14 شکل1-7: مورفولوژی فیبروبلاستی سلولهای بنیادی مزانشیمال از مغز استخوان ..................................
15 شکل 1-8: کنام سلولهای بنیادی مغز استخوان .............................................................................................
16 شکل 1-9: کاربرد سلول بنیادی مزانشیم در درمان ........................................................................................
17 شکل1-10: استفاده از سلول بنیادی مزانشیم در ترمیم جراحات استخوان ..............................................
18 شکل1-11: ساختمان استخوان ...........................................................................................................................
19 شکل1-12: منشا سلولهای تشکیل دهنده استخوان .....................................................................................
22 شکل 1-13: فرآیند استخوانی شدن درون غضروفی .......................................................................................
22 شکل 1-14: استخوان‌سازی درون‌غشایی ...........................................................................................................
24 شکل1-15: دوباره‌سازی استخوان، جذب استخوان .........................................................................................
26 شکل1-16: مراحل فرآیند استئوژنیک و ژنهای کنترلی آن ...........................................................................
27 شکل1-17: تصویر شماتیک از مسیر سیگنال دهی Wnt ............................................................................
29 شکل 1-18: جایگاه بور در جدول تناوبی عناصر ..............................................................................................
30 شکل 1-19: اسید بوریک .....................................................................................................................................
35 شکل 1-20: کمپلکس دی آدنوزین فسفات با بور ...........................................................................................
36 شکل 1-21 : میانکنش بور با جایکاه فعال آنزیم سرین پروتئاز ....................................................................
37 شکل1- 22: آنتی بیوتیک تارترولون ...................................................................................................................
39 شکل1- 23: Bortezomib ...............................................................................................................................
42 شکل 1-24: شکلگیری کمپلکس رامنوگالاکتورونات در دیواره سلولی گیاهان ........................................
51 شکل 2-1: انجام فلش اوت مغز استخوان ..........................................................................................................
52 شکل 2-2 نحوه قرار دادن فلاسک به انکوباتور .................................................................................................
53 شکل 2-3: لام نئوبار ..............................................................................................................................................
55 شکل 2-4: ساختار آلیزارین رد ............................................................................................................................
55 شکل 2-5: ماتریکس استخوانی رنگ آمیزی شده با آلیزارین رد...................................................................
56 شکل 2-6: ساختار تریپان بلو ..............................................................................................................................
57 شکل 2-7: تغییر رنگ MTT بر اثر آنزیم¬های میتوکندریایی و تولید بلور فورمازان ..............................
58 شکل 2-8: دستگاه ELISA READER .....................................................................................................
59 شکل 2-9: نمودار استاندارد MTT ....................................................................................................................
61 شکل 2-10: توانایی تشکیل کلونی (CFA) .....................................................................................................
61 شکل 2-11: ساختمان کریستال ویولت .............................................................................................................
64 شکل 2-12: میکروسکوپ فلورسانس المپوس .................................................................................................
64 شکل 2-13: ساختار رنگ فلورسنس هوخست .................................................................................................
64 شکل 2-14: ساختار رنگ فلورسنت آکریدین اورنژ .........................................................................................
66 شکل 2-15: نمودار استاندارد لاوری ...................................................................................................................
67 شکل 2-16: آسپارتات آمینوترانس¬آمیناز ...........................................................................................................
67 شکل 2-17 آلانین ترانس آمیناز...........................................................................................................................
68 شکل2-18 کیت های آنزیمی ALT، AST و ALP ...................................................................................
69 شکل2-19 : لاکتات دهیدروژناز ..........................................................................................................................
شکل 2-20: منحنی استاندارد آنزیم های اکسیدوردوکتاز................................................................
70 شکل 2-21: آلکالین فسفاتاز..................................................................................................................................
72 شکل 2-22: غلظت های مشخص مورد استفاده در رسم منحنی استاندارد ...............................................
72 شکل 2-23: نمودار غلظت های مشخص از رنگ آلیزارین رد .......................................................................
76 شکل 2-24: دستگاه اسپکتوفتومتر ....................................................................................................................
77 شکل2-25 : نمای شماتیک دستگاه فلیم فتومتر ............................................................................................
78 شکل2-26: دستگاه فلیم فتومتر ........................................................................................................................
79 شکل2-27: نمودار استاندار سدیم .......................................................................................................................
79 شکل2-28: نمودار استاندارد پتاسیم ...................................................................................................................
83 شکل3-1. مراحل رشد سلولهای بنیادی مزانشیم طی پاساژ‌های مختلف ................................................
86 شکل 3-2. رنگ آمیزی فلورسنت سلول های با فلورسنس رنگ هوخست ................................................
87 شکل 3-3. رنگ آمیزی سلول بنیادی مزانشیم تمایزیافته با رنگ آکریدین اورنژ .................................
88 شکل 3-4: تصاویر میکروسکوپی و ماکروسکوپی کلونی های تشکیل شده ................................................
95 شکل 3-5 رنگ آمیزی فلورسنت سلول های بنیادی تمایزیافته با فلورسنس رنگ هوخست ................
96 شکل 3-6. رنگ آمیزی فلورسنت سلول های بنیادی تمایز یافته با فلورسنس رنگ آکریدین اورنژ
98 شکل 3-7A:تصاویر ماکروسکوپی ماتریکس¬های رنگ¬آمیزی شده با آلیزارین رد ......................................
99 شکل 3-7B: تصاویر میکروسکوپی ماتریکس¬های رنگ¬آمیزی شده با آلیزارین رد ....................................
115 شکل 4-1: نمای شماتیک تغییرات بیوشیمیائی احتمالی در روندکاهش متابولیزم گلوکز..............
فهرست جداول
جدول1-1: سلولهای مشتق شده از سلولهای خونساز و مزانشیم مغز استخوان ......................... 12
جدول1- 2: منابع طبیعی بور .............................................................................................................................. 33
جدول1- 3: غلظت بور در بافت های مختلف ................................................................................................... 43
جدول1-4: وابستگی جذب بور به جنس و وزن ............................................................................................... 44
جدول 3-1 مقایسه میانگین توانایی زیستی سلول ها با رنگ¬آمیزی تریپان¬بلو ...................................... 84
جدول 3-2 مقایسه میانگین توانایی زیستی سلول با تست MTT ............................................................. 85
جدول3-3 مقایسه میانگین قطر هسته و مساحت سیتوپلاسم سلو لهای بنیادی مزانشیم.......... 87
جدول3-4 مقایسه میانگین تعداد و قطر کلونی های تشکیل شده توسط سلولهای مزانشیم.......... 89
جدول 3-5 مقایسه میانگین تعداد دوبرابرشدگی جمعیت سلول های بنیادی مزانشیم .................... 89
جدول 3-6 مقایسه میانگین فعالیت (IU/L) آنزیم های (AST)، (ALT)، (LDH) و (ALP) سلول¬های بنیادی مزانشیم .................................................................................................................................... 91
جدول 3-7 مقایسه میانگین میزان کلسیم، سدیم و پتاسیم داخل سلولی مزانشیم ................................ 92
جدول 3-8 مقایسه میانگین توانایی زیستی سلول های استئوژنیک با تست MTT .............................. 93
جدول 3-9 مقایسه میانگین قطر هسته (میکرومتر) سلو لهای استئوژنیک ............................................... 94
جدول 3-10 مقایسه میانگین مساحت سیتوپلاسم سلو لهای استئوژنیک ................................................ 94
جدول 3-11 مقایسه میانگین میزان رنگ (میلی¬گرم) آلیزارین رد استخراج شده از سلول های استئوژنیک 97
جدول 3-12 مقایسه میانگین میزان کلسیم (میلی¬گرم بر دسی¬لیتر) در نمونه¬های استئوژنیک 100
جدول 3-13 مقایسه میانگین میزان فعالیت آنزیم ALP (IU/L)در نمونه های استئوژنیک ............... 101
جدول 3-14 مقایسه میانگین میزان فعالیت آنزیم AST (IU/L)در نمونه های استئوژنیک .............. 102
مقایسه میانگین میزان فعالیت آنزیم ALT (IU/L)در نمونه های استئوژنیک ........................................ 102
جدول 3-16 مقایسه میانگین میزان فعالیت آنزیم LDH (IU/L)در نمونه های استئوژنیک .............. 103
جدول 3-17 مقایسه میانگین میزان سدیم در نمونه های استئوژنیک ....................................................... 104
جدول 3-18مقایسه میانگین میزان پتاسیم در نمونه های استئوژنیک ...................................................... 104
چکیده
مقدمه: بور ریز مغذی ضروری برای گیاهان است و مطالعات نشان داده که این عنصر می تواند به عنوان یک ریزمغذی برای حیوانات و انسان نیز محسوب شود. در این پژوهش به منظور درک بهتر از نقش بور، اثر دوزهای مختلف اسید بوریک بر توانایی حیات، تکثیر، تمایز و فاکتورهای بیوشیمیائی سلولهای بنیادی مزانشیم مغز استخوان رت (MSCs) مورد بررسی قرار گرفت. مواد و روش¬ها: MSCs تا سه پاساژ کشت و برای بررسی توان تکثیر و تمایز در محیط-های کشت فاقد ترکیبات استئوژنیک و واجد ترکیبات استئوژنیک آلوده به اسید بوریک قرار داده شد. در بخش اول که شامل بررسی توانائی تکثیر میشود، توانایی حیات با کمک تست MTT و تریپان بلو در زمانهای 12، 24و 36 ساعت بررسی و دوزهای 6 نانو، میکرو و میلی¬گرم بر میلی-لیتر اسید بوریک و زمان 36 ساعت جهت انجام مطالعه انتخاب گردید. در ادامه، توانائی تکثیر با استفاده از توانایی تشکیل کلونی (CFA) و دو برابرشدگی جمعیتی (PDN)، مورفولوژی سلول ها توسط رنگ آمیزی فلوروسنس، سطح الکترولیت¬های سدیم، پتاسیم با استفاده از فلیم فتومتر و میزان کلسیم، میزان فعالیت آنزیم¬های LDH، ALP ،AST و ALT توسط کیتهای تجاری ارزیابی شد. در بخش دوم که شامل بررسی توانائی تمایز میشود، تاثیر دوز 6 نانو و میکروگرم بر میلی¬لیتر به عنوان دوزهای منتخب در زمانهای 5، 10، 15 و 21 روز بر توانایی زیستی، مورفولوژی، سطح الکترولیتها و فعالیت آنزیم هایLDH ،AST و ALT در سلول ها تمایز یافته بررسی شد. میزان تمایز با استفاده از روش کمی آلیزارین رد، غلظت کلسیم و فعالیت آنزیم ALP مورد ارزیابی قرار گرفته و داده ها توسط روش آماری ANOVA، آزمون tukey آنالیز و p<0/05 به عنوان سطح معنی دار در نظر گرفته شد. نتایج: نتایج بدست آمده نشان داد که در سلول های مزانشیم میزان توانایی زیستی در دوز و زمان کم تغییر نمی کند، اما افزایش در هر دو فاکتور زمان و دوز، کاهش فعالیت آنزیم¬های متابولیکی و متعاقبا حیات را بدنبال داشت. در سلول¬های استئوژنیک فقط در دوز بالا و با گذشت زمان منجر به کاهش توانایی حیات سلولی شد و دوز 6 نانوگرم هیچ اثری بر روی توانایی حیات نشان نداد ضمنا فاکتورهای تمایزی، الکترولیتها و آنزیمهای متابولیکی با افزایش زمان فقط در دوز 6 نانوگرم افزایش یافت. نتیجه گیری: تاثیر اسید بوریک به نوع سلول و شرایط تیمار وابسته است به گونه ای که در این مطالعه نشان داده شد که حساسیت سلول¬های مزانشیم نسبت به سلول¬های استئوبلاست بیشتر است. علاوه بر این دوز پایین اسیدبوریک دارای تاثیر مثبتی بر روند تمایز استخوان بود، لذا دوزهای پایین اسید بوریک می تواند نقش مفیدی بر سلامت سلول های مزانشیم و تمایز آنها به استئوبلاست داشته باشد.
کلید واژه¬ها: سلول ¬های بنیادی مزانشیم مغز استخوان، اسید بوریک، قابلیت حیات، آنزیم¬های متابولیکی، تمایز
پایان نامه بررسی اثر بوریک اسید بر مورفولوژی و توان زیستی سلول های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان رت
